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PRAKTIKUM AM KIT

kit tAm 27.10.2022 hatten wir als Biologie-Leistungskurs der JG2 mit unserer Lehrerin Frau Janson die Chance, im Rahmen eines Praktikums zum genetischen Fingerabdruck, das Fortbildungszentrum für Technik und Umwelt des KITs zu besuchen. Dort starteten wir nach einer kurzen Sicherheitseinweisung zum Arbeiten in einer solchen Gentechnischen Anlage und kurzer Einführung in die Theorie des ersten Teils des Praktikums, der DNA-Isolation, direkt in das Praktische Arbeiten.

Im ersten Schritt haben wir uns selbst Mundschleimhautzellen entnommen, diese in eine Salzlösung gegeben und mithilfe „Chelex“ den DNA-Abbauenden Proteinen, die sich im Zellplasma der Zelle befinden das Magnesium entzogen, sodass diese funktionsunfähig wurden. Dies war notwendig, da bei der Durchführung des Praktikums die Zellen durch Inkubation (erhitzen, hier: auf 56°C für 1h) „aufgebrochen“ werden mussten und so die sicher im Zellkern gelegene DNA mit diesen Proteinen in Kontakt kommen und von ihnen zerstört werden würde.

Nach einer kurzen Kaffeepause und der Einführung in die Theorie des zweiten Teils unseres Praktikums trennten wir die nun gelösten DNA-Fragmente von den übrigen Feststoffen wie beispielsweise Zellfragmente oder Chelux-kugeln, die sich nach dem Zentrifugieren am Boden des Probenbehälters angesammelt hatten mit Mikropipetten, die exakte Mikroliter, also tausendstel von einem Milliliter, pipettieren können. Zudem fügten wir der Probenlösung DNA-Primer, Taq DNA-Polymerase, einen Reaktionspuffer sowie Nukleosidtriphosphate und einen Fluoreszenzfarbstoff „GelGreen“ hinzu. Trotzt all dieser Zugaben, war unsere Probe, die wir schlussendlich verwendeten im Gesamtvolumen nur 25µl groß. Um den Genetischen Fingerabdruck aus dieser Probe zu ermitteln, kamen wir nun zum Hauptteil unseres Praktikums, der „Polymerase Chain Reaction“, kurz PCR.

Dabei durchlief die Probe aufeinanderfolgende 27 Zyklen. Zuerst wurde sie 30sec auf 90-100°C erhitzt, sodass die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen der Stränge aufgelöst und somit die Doppelhelix in ihre zwei Einzelstränge „aufgebrochen“ wird. Anschließend kühlten wir die Probe für 30sec auf 50-70°C herunter, um die DNA-Primer jeweils an das Ende der Einzelstränge binden zu können, die dem Enzym die Startstelle der Synthese zu markieren, also der Stelle, an der das Enzym anfängt, den Strang hinabzuwandern und die „umherschwimmenden“ Nukleoside an deren komplementäre Partner zu binden. Zuletzt wurde die Probe für 40sec erneut auf 72°C erhitzt, da dies die optimale Temperatur für die Taq DNA-Polymerase ist um effizient zu Synthetisieren. Diese spezielle Taq-Polymerase stammt dabei aus hitzebeständigen Bakterien um die hohe Temperatur im Denaturierungsprozess zu „überleben“. Da nach je einem Zyklus die Doppelstränge „aufgebrochen“ und neu synthetisiert wurden, also das Genmaterial verdoppelt wurde, entstehen 230 ≈ 109 Stränge aus einem Doppelstrang. Das heißt, nach kurzer Zeit können kleinste Teile der DNA in eine riesige Menge vervielfacht werden. Diese PCR-Reaktion lief maschinell in einem Thermocycler ab während wir uns in der Mittagspause gestärkt haben.

Als letzten Teil des Praktischen Arbeitens führten wir mit unseren Proben eine Gelelektrophorese durch. In dieser stellten wir aus einem Gelierenden Gel, dem „Agarosegel“, eine „Matte“ her, in die wir mit einem Kamm vor dem Gelieren kleine Taschen formten. Diese Matte wurde in eine Vorrichtung gelegt, an die eine Spannung angelegt werden konnte und wurde in einer Lösung „versenkt“. Da in der Pufferlösung unserer Probe Glycerin enthalten war, weist diese eine erheblich höhere Dichte auf und sinkt beim Pipettieren in die Lösung, genau über der Tasche des Agarosegels, problemlos in diese hinein. Nach erfolgreichem Befüllen wurde die Spannung angelegt und die am negativen Pol gelegene DNA wandert durch die eigene negative Ladung je nach Größe und Gewicht unterschiedlich schnell und weit durch das fasrige Gewebe des Agarosegels hin zum positiven Pol. Als Überbrückung dieser Zeit, erhielten wir interessante Einblicke in die Geschichte und Arbeit des KITs in Form eines Vortrags in der Hauseigenen Dauerausstellung sowie die Vorführung eines spannenden Experiments.

Später wurde unter UV-Licht, durch den Farbstoff, der sich zwischen die Win-dungen der Doppel-helix gedrängt hat, das klassische Bandenmuster sichtbar, welches bei jedem unterschiedlich ist und sich somit für viele Anwendungen wie Vaterschaftstests oder Überführung von Verbrechern anbietet.

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